1. Vérifiez l’espèce hôte du ou des anticorps primaires cibles ainsi que celle du modèle d’étude

Si l’anticorps primaire est fait chez la souris : choisir un anti-souris. Si vous utilisez en parallèle un 2ème anticorps fait chez le lapin (multimarquage) : choisissez un anti-lapin “épuisé* sur la souris” et un anti-souris “épuisé* sur le lapin”.
*”épuisé” signifie que l’anticorps est pré-adsorbé contre les protéines sériques de souris ou de lapin afin qu’ils ne reconnaissent pas ces protéines. On note cette caractéristique par une annotation supplémentaire “Min X….Sr Prot” qui suit le nom de l’anticorps.
Par exemple “Min X Rat Sr Prot” indique que l’anticorps aura une faible réactivité contre les protéines sériques de rat.

Considérez également l’espèce de votre modèle d’étude

Si vous travaillez sur des échantillons protéiques purifiés, cela n’aura pas grand intérêt mais si vous travaillez sur un tissu ou des cellules humaines, par exemple, il peut être utile d’utiliser un anticorps épuisé* sur l’humain.

 

2. Si vous devez détecter 2 anticorps primaires d’une même espèce

Si vous travaillez avec des monoclonaux d’isotypes distincts (IgG1 et IgG2 par exemple), vous pourrez utiliser des anticorps secondaires isotypes spécifiques.
Si vous travaillez avec des polyclonaux ou des isotypes identiques, la solution la plus simple consistera à coupler directement vos anticorps primaires avec le marqueur de votre choix ou à utiliser les fragments Fab.

 

3. Quelles différences entre IgG totales, fragments F(ab’)2 et F(ab) ?

  • Les IgG totales : (~150kDa) sont les plus communs et les plus abordables. Ils peuvent être utilisés pour la plupart des applications.
  • Les fragments F(ab’)2 : (~110kDa) suppression du fragment Fc par digestion à la pepsine. Ces fragments bivalents (2 sites de reconnaissance de l’antigène) sont utiles pour éviter le bruit de fond dans des applications sur cellules vivantes exprimant un récepteur au Fc, ou d’autres applications faisant intervenir les protéines A ou G.
  • Les fragments F(ab) : (~50kDa) suppression du fragment Fc et de la région charnière. Ces fragments monovalents (1 seul site de reconnaissance) sont principalement utilisés pour des applications de blocage.

 

4. Quelles différences entre : anti-IgG(H+L), anti-IgG Fc/Fcg et anti -IgG F(ab’)2

  • Anti-IgG(H+L) : Reconnaissent la chaine lourde (Heavy = H) et chaine légère (Light = L) des IgG. Ce sont les anticorps secondaires les plus utilisés car leur spectre de reconnaissance est le plus large. Les chaines légères étant identiques entre les différentes classes d’Ig (IgM, IgA, IgD, IgE), les anti-IgG(H+L) pourront cross-réagir avec ces autres classes.
  • Anti-IgG Fc/Fcy : Ils réagissent avec le fragment Fc des chaines lourdes des IgG. Dans certains cas, ils sont également testés (ou pré-adsorbés) pour minimiser les cross-réactions avec les IgM et/ou IgA, et seront alors nommés anti-IgG, Fcy.
  • Anti-IgG,F(ab’)2 : Ils reconnaissent la portion F(ab’)2/Fab des IgG et ne montrent pas de réaction avec le fragment Fc. La reconnaissance se fait donc via les chaines légères. Ils ne sont donc pas spécifiques des IgG mais peuvent également reconnaitre d’autres classes d’Ig qui présentent les mêmes chaines légères.

5. Comment diminuer le bruit de fond généré par mon anticorps secondaire ?

  • Vérifiez vos étapes de blocage : on obtient souvent de bons résultats en utilisant une dilution à 5% d’un sérum correspondant à l’espèce hôte de l’anticorps secondaire (mais surtout pas celle de l’anticorps primaire car les Ig présentes dans le sérum pourraient être reconnues par le secondaire).
    Exemple : Si votre anticorps primaire est fait chez la souris et que vous le révélez avec un Chévre anti-Souris : utilisez un sérum de chèvre pour bloquer.
  • Attention au lait et à la BSA ! Ces agents de blocage courants contiennent souvent des traces d’immunoglobulines bovines qui sont assez similaires aux immunoglobulines de chèvre ou de mouton. A ne pas utiliser si votre anticorps primaire a été produit chez le bovin, la chèvre ou le mouton, car votre secondaire risque de reconnaitre l’agent de blocage en même temps que l’anticorps primaire et générer du bruit de fond.
  • Sélectionnez si possible un anticorps épuisé contre l’espèce de votre modèle expérimental. Si vous travaillez sur un tissu humain, choisissiez un anticorps pré-adsorbé sur l’humain (voir premier paragraphe). Si votre tissu contient des immunoglobulines endogènes, un blocage avec des fragments Fab pourra être utile (Fab anti humain s’il s’agit d’Ig humaines endogènes).
  • Contrôlez un éventuel problème de lavage (trop de lames/blots dans un même bain de lavage, durée de lavage à augmenter pour les tissus épais…)
  • Vérifiez si la dilution utilisée pour l’anticorps secondaire n’est pas trop concentrée.

 

En savoir plus :